Натриевая соль хондроитина сульфата (Na-ХС), представляющая собой полимерный гликозаминогликан (мукополисахарид), является одним из важнейших компонентов хрящевой ткани суставов [3]. Противовоспалительное и хондропротективное действие, а также хорошая переносимость и высокая степень безопасности даже при длительном применении данного соединения продемонстрированы в экспериментальных и клинических исследованиях [5, 10]. Препараты на основе Na-ХС в различных лекарственных формах длительное время применяются в клинической практике и эффективно используются в комплексной терапии артрологических заболеваний [8, 13, 15].
В ФБУ «ГИКиМП» на протяжении длительного времени изучают хондроитина сульфат и получают его соли с различными элементами – натрием, медью, алюминием и т.д. Алюминиевая соль хондроитина сульфата (Al-ХС) является перспективным соединением с гастропротекторным действием за счет противовоспалительного эффекта хондроитина и антацидных свойств алюминия.
В настоящее время для всесторонней оценки новых соединений достаточно широко применяют методы компьютерного моделирования, получивших общее название in silico (от in silicon, т.е. «в кремнии») [14]. Подход in silico является многоуровневым, с его использованием исследователь, основываясь только на структуре соединения, имеет возможность смоделировать разнообразные характеристики и взаимодействие отдельных молекул, биохимические процессы и функционирование отдельных физиологических систем.
В Институте биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН разработаны алгоритмы прогнозирования спектра активности и предсказания токсичности, на основе которых созданы веб-сервисы, доступные в онлайн-режиме [1, 2]. Данные специализированные программные продукты предсказывают более 4300 видов биологической активности, механизмов действия и специфической токсичности потенциально перспективных соединений, основываясь на их структурных формулах со средней точностью прогноза около 95 %, [6, 12].
Целью настоящего исследования явилось сравнительное изучение острой токсичности натриевой и алюминиевой солей хондроитина сульфата на основании компьютерного прогнозирования (in silico) и экспериментального исследования на животных (in vivo).
Материалы и методы исследования
Прогноз острой токсичности исследуемых соединений – натриевой и алюминиевой солей хондроитина сульфата (Na-ХС и Al-ХС) ‒ осуществляли с использованием программного продукта GUSAR (General Unrestricted Structure-Activity Relationships) [1, 12].
Экспериментальная работа по изучению острой токсичности выполнена на беспородных крысах-самцах (массой 180–200 г) по 6 особей в группе сравнения.
Для исследования острой токсичности использовали субстанцию хондроитина сульфата натрия (производства Bioiberica, Испания) и алюминиевую соль хондроитина сульфата, полученную в лаборатории мукополисахаридов ФБУ «ГИКиМП».
Острую токсичность Na-ХС и Al-ХС оценивали при внутрибрюшинном, подкожном и внутрижелудочном введении. Исследуемые соединения вводили в виде суспензий, приготовленных на физиологическом растворе, контрольные животные получали физиологический раствор. Исследуемые вещества в дозах более 2 000 мг/кг вводили дробно за период времени (не более 6 часов) [7]. Продолжительность наблюдения за состоянием животных после введения веществ составляла 14 суток.
Значение показателя LD50 рассчитывали при помощи специализированной программы Probit Analysis V 0.2 (НПП «Наука Плюс», Украина), разработанной на основе метода максимального правдоподобия [11]. Величину стандартной ошибки показателя LD50 вычисляли общепринятым способом [4].
Результаты исследований и их обсуждение
Ориентируясь на данные литературы об острой токсичности Na-ХС [9] и результаты прогнозирования острой токсичности Al-ХС, исследуемые соединения вводили в диапазонах доз, значения которых приведены в табл. 1. Интервал между дозами обоих соединений являлся постоянным и подбирался индивидуально при каждом способе введения.
Таблица 1
Диапазон доз исследуемых веществ в зависимости от способа введения
|
Путь введения |
Диапазон доз, мг/кг |
|
|
Na-ХС |
Al-ХС |
|
|
Внутрибрюшинный |
1 750–3 000 (250) |
200–1 200 (200) |
|
Подкожный |
3 000–4250 (250) |
600–1 600 (200) |
|
Внутрижелудочный |
7 500–10 000 (500) |
2 000–3 500 (300) |
Примечание. В скобках приведены интервалы доз (шаг дозы) для каждого исследуемого диапазона.
При внутрибрюшинном введении симптомы интоксикации в виде угнетения, отека и затруднения дыхания появлялись через 5–10 минут и достигали максимума через 2 часа после инъекции. Выраженность симптомов отравления нарастала с увеличением дозы исследуемых веществ.
Летальность животных в экспериментальных группах наступала в течение первых суток. При вскрытии погибших животных зафиксированы обширные кровоизлияния в брюшной полости. Существенных различий в проявлении симптомов отравления и времени наступления летального исхода между Na-ХС и Al-ХС не отмечено.
После подкожного введения наблюдали картину интоксикации, сходную с таковой при внутрибрюшинном введении исследуемых веществ. Через 2 часа после подкожного введения препарата во всех дозах у экспериментальных животных также наблюдали угнетение, отек и затрудненное дыхание. Через 24 часа после инъекции состояние всех выживших животных нормализовалось. После подкожных инъекций в участке введения отмечены местные реакции в виде инфильтратов.
При внутрижелудочном введении Na-ХС во всем диапазоне исследуемых доз реакция на введение вещества отсутствовала. Смертность в экспериментальных группах не зарегистрирована. После перорального введения Al-ХС у животных отмечены гиподинамия, нарушения координации движений, учащенное дыхание. При введении больших доз вещества животные слабо реагировали на внешние раздражители. Данные симптомы возникали через 10–15 минут с момента введения и достигали максимальной выраженности проявлений через 1,5–2 часа после поступления в организм Al-ХС. Случаи летального исхода фиксировались в первые 18–20 часов. Через сутки состояние выживших животных не отличалось от физиологической нормы. Местно-раздражающего действия при данном пути поступления в организм не обнаружено.
Результаты предсказания острой токсичности Na-ХС и Al-ХС для крыс с использованием программного продукта GUSAR и значения показателей острой токсичности, полученные экспериментально, сведены в табл. 2.
Таблица 2
Значения показателей острой токсичности Na-ХС и Al-ХС по результатам исследований in vivo и in silico [1, 12] в зависимости от способа введения
|
Путь введения |
LD50, мг/кг |
|
|
Na-ХС |
Al-ХС |
|
|
in silico |
||
|
Внутрибрюшинный |
2612 |
609 |
|
Подкожный |
3856 |
1084 |
|
Внутрижелудочный |
7453 |
3250 |
|
In vivo |
||
|
Внутрибрюшинный |
2708±315 |
700±161 |
|
Подкожный |
3625±201 |
1035±112 |
|
Внутрижелудочный |
> 10000 |
2802±224 |
Результаты компьютерного моделирования острой токсичности Na-ХС близки к значениям острой токсичности данного соединения по данным литературы: LD50 при внутрибрюшинном введении составляет 2 900 мг/кг, при внутрижелудочном введении – более 10 000 мг/кг, при подкожном введении 3 700 мг/кг.
Значения показателей LD50 как для Na-ХС, так и для Al-ХС, при внутрибрюшинном и подкожном способах введения по результатам прогнозирования и на основании экспериментальных данных существенно не отличаются. Разница для каждого соединения в зависимости от пути поступления в организм находится в пределах величины стандартной ошибки показателя.
При внутрижелудочном введении значение LD50 для Na-ХС по прогнозу оказалось на 25 % ниже, чем его величины, полученные in vivo и приведенные в литературе. По результатам исследования in vivo Na-ХС является менее токсичным соединением, чем на основании результатов компьютерного моделирования.
Для Al-ХС при пероральном введении наблюдался противоположный эффект – экспериментально установленная величина LD50 на 14 % меньше, чем по результатам компьютерного моделирования. На основании оценок in vivo Al-ХС обладает более высокой токсичностью, чем по данным прогноза in silico.
Заключение
Значения показателей острой токсичности Na-ХС и Al-ХС, полученные на основании компьютерного моделирования и в эксперименте на животных, являются достаточно близкими для каждого из изученных веществ при соответствующем пути введения. Таким образом, результаты предсказания острой токсичности новых соединений могут служить ориентиром при скрининге фармакологически перспективных соединений.
Установлено, что Al-ХС является малотоксичным соединением. При внутрижелудочном введении Al-ХС не оказывает местно-раздражающего действия, значение LD50 при данном пути поступления значительно превышает терапевтические пероральные дозы для препаратов с антацидным и гастропротекторным действием. Алюминиевая соль хондроитина сульфата является перспективным соединением для дальнейших исследований специфической фармакологической активности с целью создания нового лекарственного препарата.
Рецензенты:
Рожнов Г.И., д.м.н., профессор, консультант лаборатории биомоделей, ФБУ «Государственный институт кровезаменителей и медицинских препаратов» Министерства промышленности и торговли РФ, г. Москва;
Суханов Ю.С., д.м.н., профессор, зав. лабораторией технологии кровезаменителей, ФБУ «Государственный институт кровезаменителей и медицинских препаратов» Министерства промышленности и торговли РФ, г. Москва.
Работа поступила в редакцию 20.08.2013.