Иммунная система является высоко специализированной, сложно регулируемой системой, её клеточные элементы находятся в состоянии постоянной пролиферации. В этой связи любое токсическое воздействие химического вещества обязательно амплифицируется [3]. Для задач ранней диагностики нарушений здоровья при различных путях поступления химических веществ в организм, в том числе аэрогенным способом, актуальным является изучение особенностей ответных реакций иммунной системы на воздействие.
Цель работы – оценить особенности изменения апоптоза у детей, проживающих в условиях внешнесредового хронического аэрогенного воздействия фенола.
Материалы и методы исследования
Исследование выполнено на примере детского населения, проживающего в различных санитарно-гигиенических условиях среды обитания. Биомедицинские диагностические исследования у детей выполнены в соответствии с обязательным соблюдением этических принципов медико-биологических исследований, изложенных в Хельсинкской декларации 1975 года с дополнениями 1983 года. Исследование одобрено Этическим комитетом Федерального научного центра медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения (протокол № 10 от 17.10.2011 г.). Критерии включения в исследование: возраст детей от 4 до 7 лет, проживание на исследуемых территориях. Критерии исключения: невозможность или нежелание родителей обследуемых детей дать информационное согласие на участие в исследовании, участие обследуемых детей в другом исследовании. Все родители (опекуны) подписали информированное согласие на участие в исследовании и использовании персональных данных. Группу наблюдения составили 154 ребенка (средний возраст 7,20 ± 0,14 лет, мальчиков – 75 человек (48,7 %), девочек – 79 человек (51,3 %)). Группу контроля составили 93 ребенка (средний возраст 6,58 ± 0,13 лет, мальчиков – 39 человек (41,9 %), девочек – 54 человека (54,1 %)), проживающих на территории относительного санитарно-гигиенического благополучия (контрольная территория). На втором этапе исследований для установления диапазонов ответных реакций иммунной системы на воздействие дети, проживающие в условиях экспозиции, были поделены на подгруппы с учетом содержания анализируемого компонента в образцах крови. Группы обследуемых не отличались между собой по гендерному и возрастному составу. Группа наблюдения и контрольная группа были сопоставимы по возрастному и гендерному составу. Выборка обследуемых была достаточна для достоверного определения межгрупповых отличий.
Для выявления воздействия химических факторов среды обитания на состояние здоровья проведены натурные исследования содержания приоритетных загрязняющих веществ (фенол) в атмосферном воздухе на территориях исследования. Идентификация фенола в биосредах (кровь) выполнялось на капиллярном газовом хроматографе «Кристалл 5000» (ЗАО СКБ «Хроматэк», Russia) в соответствии с методическими указаниями «Сборник методик по определению химических соединений в биологических средах», утвержденными Минздравом России 06.09.99. № 763-99 – 4.1.779.-99.
Фенотипирование лимфоцитов, идентификацию мембранных и внутриклеточных маркеров апоптоза, детекцию апоптоза проводили на проточном цитометре FACSCalibur фирмы «Becton Dickinson» («BD», USA). Определение субпопуляций лимфоцитов (CD95 + (FAS)) проводили методом мембранной иммунофлюоресценции с использованием панели меченых моноклональных антител (МКАТ) к мембранным CD-рецепторам («BD», USA). Для определения уровня экспрессии рецептора к фактору некроза опухоли-α 1-го типа (TNFRI) использовали цитофлюориметрический метод, основанный на взаимодействии соответствующих МКАТ с мембранным рецептором к TNFα на лимфоцитах «Becman Coulter» («ВС», USA). Определение внутриклеточного маркера апоптоза – р53-протеина, проводилось с помощью МКАТ против белка р53, конъюгированные с PE (фикоэритрин) («ВС», USA). Для определения количества апоптотических клеток использовали суспензию мононуклеарных клеток периферической крови, выделенных центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографина («Pharmacia Fine Chemicals», Швеция) [6]. Уровень апоптоза лимфоцитов определяли с помощью окрашивания аннексином V-FITC (Annexin V-FITC (Fluorescein Isothiocyanate)) и 7-аминоактиномицином D (7-AAD (7-aminoactinomycin D) согласно протоколу фирмы-производителя («BС», USA). Annexin V-FITC+ 7-AAD- – ранний апоптоз (апоптотические клетки).
Для выбора критериев оценки значимости межгрупповых различий средних проверяли соответствие формы выборочных распределений нормальному, используя критерий χ2, а также контролировали равенство генеральных дисперсий с помощью F-критерия Фишера. В случае отклонения от нормального распределения, для сравнения данных использовали непараметрический U-критерий Манна–Уитни. При соответствии данных нормальному распределению использовали t-критерий Стьюдента. Результаты исследования представлены в виде среднего значения (М) и ошибки средней (m) изученных показателей. Во всех процедурах статистического анализа рассчитывался достигнутый уровень значимости (p), при этом критический уровень значимости в данном исследовании принимался равным 0,05 [1, 5].
Результаты исследования и их обсуждение
При исследовании качества атмосферного воздуха на территории наблюдения зарегистрированы превышения фенола до 2,04 ПДКс.с (предельно допустимая концентрация среднесуточная) и до 1,9 ПДКм.р (предельно допустимая концентрация максимально разовая). На контрольной территории не обнаружено присутствие изучаемого органического соединения (фенол) ни в одной из проанализированных проб. Качество атмосферного воздуха на контрольной территории соответствует гигиеническим нормативам.
Средняя концентрация фенола в крови детей, проживающих на территории наблюдения, статистически значимо (р < 0,05) превышает фоновый региональный уровень (0,010 ± 0,001 мг/дм3) и значения, зафиксированные у детей с контрольной территории (табл. 1). В условиях длительной экспозиции фенолом у экспонируемого населения в крови регистрируется фенол, который можно рассматривать как маркер экспозиции [4, 7]. Отмечено, что у детей, постоянно проживающих в зоне экспозиции, статистически значимо (р < 0,05) снижено количество СD95 + -рецептора и TNFRI-рецептора на Т-лимфоцитах относительно результатов, полученных в группе контроля.
Таблица 1
Маркеры экспозиции и маркеры эффекта иммунной системы у детей, проживающих в зоне внешнесредового воздействия фенола (M ± m)
|
Показатели |
Группа контроля (n = 93) |
Группа наблюдения (n = 154) |
р |
|
Концентрация фенола в крови |
|||
|
Диапазон концентрации, мг/дм3 |
0,001–0,030 |
0,010–1,860 |
|
|
Среднее значение, мг/дм3 |
0,0107 ± 0,001 |
0,2227 ± 0,0287 |
0,000 |
|
Характеристика биомаркеров апоптоза с учетом уровня фенола в крови |
|||
|
СD95+, % |
27,13 ± 1,05 |
17,15 ± 0,66 |
0,000 |
|
р53, % |
1,23 ± 0,11 |
0,57 ± 0,05 |
0,000 |
|
TNFRI, % |
1,29 ± 0,10 |
0,47 ± 0,04 |
0,000 |
|
Annexin V-FITC + 7-AAD-, % |
1,72 ± 0,16 |
0,82 ± 0,05 |
0,001 |
Примечание: р – различие между основной группой и группой контроля по средним величинам р < 0,05.
Анализ иммунограмм продемонстрировал, что у детей, проживающих в условиях внешенсредовой экспозиции фенолом, статистически значимо (р < 0,05) реже идентифицируется внутриклеточный белок р53, а также достоверно снижено (р < 0,05) количество Annexin V-FITC + 7-AAD- -клеток по сравнению с аналогичными показателями, выявленными в контрольной группе.
Все обследуемые дети, проживающие в условиях экспозиции, были поделены на группы с учетом содержания фенола в образцах крови. Результаты обследования выявили, что у детей II группы среднее содержание фенола в крови статистически значимо (р < 0,05) превышает среднегрупповое содержание анализируемого компонента в образцах крови детей I группы (табл. 2). Оценка иммунного статуса показала, что у детей II группы статистически значимо (р < 0,05) повышено количество Т-лимфоцитов, экспрессирующих СD95-антиген в сравнении с результатами, полученными у детей I группы. Обнаружено, что у детей при контаминации биосред фенолом выше 0,081 мг/дм3 статистически значимо (р < 0,05) повышается процентное содержание Annexin V-FITC + 7-AAD- -лимфоцитов относительно значений, полученных у обследуемых I группы. Анализ иммунограмм выявил, что у детей II группы статистически значимо (р < 0,05) снижена экспрессия белка р53 и TNFRI в сравнении с результатами, зарегистрированными у детей I группы.
Таблица 2
Сравнительная характеристика диапазонов маркеров апоптотической регуляции у детей группы наблюдения, проживающих в зоне внешнесредового воздействия фенола, отличающихся уровнем содержания фенола в крови (M ± m)
|
Показатели |
I группа (n = 90) |
II группа (n = 64) |
р1 |
|
Концентрация фенола в крови |
|||
|
Диапазон концентрации, мг/дм3 |
0,010–0,080 |
0,081–1,860 |
|
|
Среднее значение, мг/дм3 |
0,041 ± 0,010 |
0,412 ± 0,020 |
0,000 |
|
Характеристика биомаркеров апоптоза с учетом уровня фенола в крови |
|||
|
СD95 + , % |
15,29 ± 0,4 |
20,22 ± 1,3 |
0,005 |
|
р53, % |
0,75 ± 0,12 |
0,39 ± 0,08 |
0,010 |
|
TNFRI, % |
0,61 ± 0,17 |
0,30 ± 0,03 |
0,002 |
|
Annexin V FITC+ 7-AAD–, % |
0,56 ± 0,20 |
0,99 ± 0,06 |
0,002 |
Примечание: р1 – различие между I группой и II группой по средним величинам р < 0,05.
Обнаружено, что фенол в наибольшей степени ингибирует составляющие TNF- и р53-зависимого апоптоза. Максимальное статистически значимое (р < 0,05) снижение экспрессии TNFRI (на 70 %) и внутриклеточного протеина р53 (на 68 %) по отношению к контрольным значениям идентифицированы при содержании фенола в биосредах на уровне 0,081–1,864 мг/дм3. Однако фенол в данном диапазоне концентрации формирует наименьшие изменение показателей, характеризующих FAS-зависимый апоптоз: статистически значимое (р < 0,05) снижение экспрессии CD95+-клеток (до 11 %) в сравнении с контрольными цифрами. Наименьшее отклонение параметров TNF- и р53-зависимого апоптоза от контрольных цифр прослеживается при концентрации фенола в крови от 0,01 до 0,08 мг/дм3. Выявлены следующие изменения иммунного статуса: статистически значимое (р < 0,05) снижение количества TNFRI+-клеток (на 52 %) и экспрессии внутриклеточного белка р53 (на 39 %) в сравнении с контрольными цифрами.
Фенольные соединения способны трансформировать компоненты клеточных сигнальных путей [9], что может приводить к изменению активационно-индуцированной гибели клетки. Фенолсодержащие соединения активируют транскрипцию металлотионеина I за счет цинк-зависимого механизма, что приводит к снижению чувствительностей тканей к действию окислительно-стрессовых факторов [2] и тем самым изменяют скорость вхождения клетки в апоптоз. Полагают, что фенолы обладают возможностью модулировать транскрипцию NF-kB фактора [8], регулирующего индуцибельную экспрессию ряда генов, участвующих в выживании и удалении клеток с помощью механизмов апоптоза.
Выводы
Таким образом, у детей, проживающих в условиях хронического внешнесредового воздействия фенола, отмечается ингибирование гибели клетки по типу апоптоза. Установлено, что диапазон концентрации фенола в крови обследуемых детей (0,010 до 1,864 мг/дм3) определяет динамику изменения показателей апоптоза. Максимальное статистически значимое (р < 0,05) снижение количества TNFR-рецептора на Т-лимфоцитах и экспрессия белка р53 идентифицировано при диапазоне концентрации фенола в биосредах от 0,081 до 1,864 мг/дм3. Для сохранения баланса между пролиферацией и гибелью клетки, то есть процесса, необходимого для сохранения популяции тех или иных клеток, в условиях экспозиции формируется компенсаторные реакции иммунной системы, которые проявляются повышением активации составляющих FAS-зависимого апоптоза на фоне ингибирования TNF- и р53-зависимого апоптоза.
Рецензенты:
Юшкова Т.А., д.м.н., профессор, Пермская фармацевтическая академия, кафедра фармакологии с курсом клинической иммунологии, г. Пермь;
Рочев В.П., д.м.н., профессор кафедры экологии человека и безопасности жизнедеятельности Пермского государственного национального исследовательского университета, г. Пермь.
Работа поступила в редакцию 04.02.2014.