Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,087

IDENTIFICATION OF HANTAAN AND AMUR HANTAVIRUSES AND ASSOCIATED INFECTIONS USING MODIFICATED HEMAGGLUTINATION INHIBITION TEST

Kushnareva T.V. 1 Kompanets G.G. 1
1 Research Institute of Epidemiology and Microbiology of G.P. Somov Siberian Branch of Russian Academy of Medical Sciences
Показана эффективность предложенных модификаций теста торможения гемагглютинации для идентификации близкородственных хантавирусов Amur и Hantaan и вызываемых ими инфекций при исследовании материала от грызунов-носителей и больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом (ГЛПС). Типирование сывороток крови от больных ГЛПС в постановке РТГА с 2 АЕ антигена (время контакта 15 минут и 2 часа при + 4 °С) серологически подтвердило установленную с помощью молекулярно-генетических исследований эпидемиологическую значимость трех хантавирусов – Amur, Hantaan и Seoul – в заболеваемости ГЛПС на территории Приморского края. Количественная оценка антигенного родства штаммов генотипов Amur и Hantaan, выделенных от их резервуарных хозяев Apodemus peninsulae и Apodemus agrarius соответственно, была проведена с помощью кинетической РТГА (4 АЕ; контакт 15 и 30 минут, 1, 2, 4 и 20 часов при + 4 °С). Установленные межтиповые антигенные различия между вирусами Amur, Hantaan, Seoul и Puumala продемонстрировали антигенную самостоятельность вируса Amur как отдельного серотипа в роду Hantavirus. Возможность ранней этиологической серодиагностики ГЛПС имеет большое практическое значение на эндемичных территориях с циркуляцией нескольких патогенных хантавирусов.
Development of new serological methods and improvement of known technique for diagnostics of hantaviral infections is slowed down by difficulties of hantavirus cultivation on tissue culture. Efficiency of our modifications of a hemagglutination inhibition assay (HI) for identification of Hantaan and Amur hantaviruses and respective type of infections was tested using blood sera from patients with hemorrhagic fever with a renal syndrome (HFRS) and hantaviral strains isolated from rodents – their natural hosts endemic species of Primorsky Krai of Russia. The identification of etiological agents in blood sera of HFRS patients using HAIT (with 2 AU of antigen) confirmed the epidemiological importance of Amur, Hantaan and Seoul hantaviruses, previously identified by molecular and genetic methods in the territory of the region. Identification of hantaviruses serotypes was carried out in cross-reaction kinetic HI assay with hantaviral antigens and immune sera prepared to prototype strains of hantaviruses. This analysis of kinetics interaction allowed to make the quantitative estimation of antigenic relations between hantaviruses based on ≥ to a 4-fold difference of antibodies titers reacted with homo- and heterological antigens. The analysis of intertype antigenic differences of the Amur virus with prototype strains of Hantaan, Seoul and Puumala hantaviruses showed antigenic independence of the Amur virus as separate serotype in the genus Hantavirus. Thus, the modifications of a hemagglutination inhibition assay as alternative of a labor-consuming neutralization test, can be used for identification of hantaviruses and the infections caused by them in areas with circulation of several etiological agents of HFRS.
hantavirus
hantaviral infections
hemorrhagic fever with a renal syndrome (HFRS)
diagnosis
hemagglutination inhibition test
1. Kushnareva T.V. Hemagglutiniruyuschie svoystva hantavirusov i poluchenie spetsificheskogo diagnostikuma: Aftoref. dis. kand. biol. nauk, Vladivostok, 2002.
2. Kushnareva T.V., Slonova R.A., Kompanets G.G. Sposob polucheniya diagnostikuma hantavirusov. Patent Rossii No 2180754, 2002, Byul., no. 8.
3. Slonova R.A., Kushnareva T.V., Kompanets G.G. Tikhookeanskiy MeditsinskiZhurnal, 2008, no. 2, pp. 5–9.
4. Slonova R.A., Kushnareva T.V., Kompanets G.G. Zh. Mikrobiol., epidemiol., immunol., 2006, no. 3, pp. 74–77.
5. Yashina L.N. Zh. Mikrobiol., epidemiol., immunol., 2006, no. 3, pp. 78–80.
6. Вrummer-Korvenkontio M., Manni T., Ukkonen S. Detection hemagglutination – inhibition antibodies in patients with Nephropathia Epidemica and Korean hemorrhagic fever by using Puumala virus cell culture antigen // J. Infect. Dis. 1986. Vol. 15. рр. 997–998.
7. Kosoy M. E., Slonova R. A., Mills J. et al. Community structure and prevalence of Hantavirus infection in rodents a geographic division of the enzootic area in Far Eastern Russia // J. Vect. Ecol. 1997. Vol. 22., Iss. 1. рр. 52–63.
8. Lee H.W., Lee P.W., Jonson K. Isolation of etiologic agent of Korean hemorrhagic fever // J. Infect, Dis. 1978. Vol. 137. рр. 298–308.
9. Manual of Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome and Hantavirus Pulmonary Syndrome / Lee H.W., Calisher C., Schmaljohn C. Korea, Seoul: WHO Collaborating Center, 1998. 258 p.
10. Okuno Y., Yamanishi K., Takahashi M. et al. Hemagglutination-inhibition test for hemorrhagic fever with renal syndrome using antigen prepared from infected culture fluid // J. Gen. Virol. 1986. Vol. 67. рр. 149–156.
11. Tsai T.F., Tang Y.W., Hu S.L. et al. Hemagglutination-ingibition antibody in hemorrhagic fever with renal syndrome // J. Infect. Dis. 1984. Vol. 150. рр. 895–898.

Основными видами диагностики вирусных инфекционных заболеваний, несмотря на разнообразие современных методов лабораторных исследований, остаются серологические тесты и классический метод выделения вирусов на культуре клеток. Успех своевременной этиологической диагностики хантавирусных инфекций в значительной степени зависит от разработки новых и совершенствования рутинных иммунологических методов исследования. Трудности, связанные с выделением на культуре клеток хантавирусов от больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом (ГЛПС) и грызунов-носителей, выдвигают на первое место серологические тесты. Для выявления специфических антител к определенному вирусу чаще всего используют метод непрямой иммунофлюоресценции (НМФА). К вирусам, обладающим гемагглютинирующими свойствами, применяют также и иммунологическую реакцию торможения гемагглютинации (РТГА), которая основана на способности сывороточных антител, вырабатываемых к гемагглютининам (специфическим белкам, содержащимся во внешней оболочке некоторых вирусов), подавлять вызываемую вирусом агглютинацию эритроцитов. После успешной изоляции прототипного штамма 76-118 вируса Hantaan [8] рН-зависимые гемагглютинины были выявлены в антигенах, полученных из мозга новорожденных мышей, клеток VERO E-6, вируссодержащих культуральных жидкостей [6, 10, 11]. Чувствительность и специфичность тестов гемагглютинации в значительной степени зависит от источника и способа получения антигенов, при этом условия репродукции вирусов оказывают заметное влияние на формирование гемагглютининов, а воздействие физических и химических факторов влияет на функциональные свойства антигенов и их стабильность [1, 10]. Было отмечено [9], что тест РТГА по своей специфичности не уступает реакции нейтрализации с использованием тканевых культур, а его применение предпочтительнее в тех регионах, где одновременно циркулируют несколько антигенных вариантов хантавирусов. На территории Приморского края с помощью молекулярно-генетических методов исследования выявлена циркуляция трех патогенных хантавирусов – Hantaan (геновариант FE), Amur и Seoul (геновариант VDV), природными хозяевами для которых установлены восточный подвид полевой мыши (Apodemus agrarius), восточно-азиатская мышь (Apodemus peninsulae) и серая крыса (Rattus norvegicus) соответственно [3–5].

Цель работы – показать эффективность модифицированных тестов торможения гемагглютинации при идентификации штаммов близкородственных вирусов Amur и Hantaan (геновариант FE), изолированных от экологически разных видов мышей рода Apodemus – A. peninsulae и A. agrarius соответственно, а также случаев заболевания ГЛПС, обусловленных этими патогенами, на территории Приморского края.

Материал и методы исследования

Гемагглютинирующие антигены штаммов – прототипных и выделенных нами на клеточной культуре VERO E-6 от грызунов-носителей хантавирусов на территории края – готовили из вируссодержащих культуральных жидкостей по разработанному способу [2]. Исследовали сыворотки крови от инфицированных хантавирусом грызунов (n = 86) и больных ГЛПС (n = 246) из трех очаговых регионов края (I – Восточно-Маньчжурский холмисто-равнинный, II – Амуро-Уссурийский предгорно-лесной, III – Сихотэ-Алиньский горно-таежный [7]) и г. Владивостока. Все больные были с серологически подтвержденным в НМФА диагнозом ГЛПС без четкого различия в титрах антител к вирусам Hantaan, Amur и Seoul. Гемагглютинирующую активность антигенов определяли в реакции гемагглютинации (РГА). Этиологическую диагностику ГЛПС у больных из разных регионов края и в разные сроки заболевания проводили в условиях модифицированной постановки РТГА – 2 активные единицы антигена (АЕ), время контакта 15 минут и 2 часа при +4 °С. Антигенные связи штаммов хантавирусов изучали в предложенной кинетической постановке РТГА (КРТГА) – 4 АЕ антигена, время контакта 15 и 30 минут, 1, 2, 4 и 18 часов при + 4 °С (табл. 1).

Таблица 1

Характеристика тестов гемагглютинации, используемых в работе

Реакции

Характеристика реакций

Реакция гемагглютинации (РГА)

Определение гемагглютинирующей активности антигенов и их рабочей дозы – 4-8 АЕ

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)

Оценка специфической гемагглютининингибирующей активности антител (антигемагглютининов) в сыворотках крови больных ГЛПС по ? 4-кратной разнице в титре антител к антигенам гомо- и гетерологичных хантавирусов

Кинетическая реакция торможения гемагглютинации (КРТГА)

Проведение серологической идентификации штаммов хантавирусов с учетом кинетики взаимодействия антигемагглютининов иммунных сывороток крови, полученных к серотипам Hantaan (HTNV), Amur (AMRV), Seoul (SEOV) и Puumala (PUUV), с гомо- и гетерологичными гемагглютинирующими антигенами хантавирусов

Внутри- и межтиповые антигенные отношения исследуемых штаммов хантавирусов оценивали в перекрестных КРТГА, при этом степень антигенного сходства или различия штаммов количественно определяли по рассчитанному в каждой реакции значению предложенного ранее показателя А [1].

Результаты исследования и их обсуждение

На первом этапе изучали эффективность теста РТГА для дифференциальной диагностики хантавирусных инфекций среди разных видов – носителей хантавирусов. Часть результатов параллельного титрования сывороток крови от инфицированных животных с гемагглютинирующими антигенами разных хантавирусов представлена в табл. 2. Специфические антитела чаще выявляли к тому хантавирусу, для которого данный вид животного является основным хозяином. В ряде случаев отмечали перекрестные реакции с гетерологичными вирусами, но титр антител к гомологичному вирусу был выше.

Таблица 2

Идентификация хантавирусной инфекции у грызунов-носителей в РТГА

Вид грызуна

Номер исследуемой сыворотки

Гемагглютинирующий антиген хантавируса / грызун-носитель

HTNV

(Apodemus agrarius)

AMRV

(A. peninsulae)

HOKV

(Myodes rufocanus)

VLАV

(Microtus fortis)

Apodemus agrarius

9189

9400

9564

9735

10360

10385

11007

10 – 640*

20

160

160

40

160

160

40

< 10–40

< 10

10

40

< 10

40

40

10

< 10–40

< 10

10

20

< 10

10

40

< 10

< 10–10

< 10

20

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

Apodemus peninsulae

5303

6670

7036

8535

9473

10497

10544

10619

10977

11050

11660

< 10–40

10

< 10

20

10

40

40

40

10

20

< 10

< 10

10–320

40

40

160

80

160

320

160

80

80

40

20

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

< 10

Myodes rufocanus

11525

10

< 10

80

20

Microtus fortis

9469

< 10

< 10

10

40

Примечание.* – титр антигемагглютининов (гемагглютининингибирующих антител).

При исследовании сывороток крови от восточно-азиатских мышей из лесных ландшафтов края СГТ антител с антигеном штамма от A. peninsulae был в 2 раза выше по сравнению с антигеном штамма от A. agrarius – 4,6 log2 и 2,3 log2 соответственно. В то же время при титровании сывороток крови полевых мышей из степных и лесостепных ландшафтных зон было получено более высокое значение СГТ антител с антигеном штамма от A. agrarius, чем с антигеном штамма от A. peninsulae – 5,7 log2 и 3,2 log2 соответственно.

На следующем этапе изучалась диагностическая эффективность модифицированной постановки РТГА для дифференциации хантавирусных инфекций у больных из разных очаговых регионов в период высокой заболеваемости ГЛПС на территории края (табл. 3).

Таблица 3

Типирование хантавирусной инфекции у больных ГЛПС из разных очаговых регионов Приморского края в модифицированной РТГА

Эпидемиологический тип очагов ГЛПС

Очаговый регион

Обследовано больных ГЛПС

Случаи ГЛПС, обусловленные вирусом *

Случаи ГЛПС не идентифицированы **

Hantaan

Amur

Seoul

Сельский тип:

I очаговый регион

II и III регионы

67

21

46

19

14

5

39

3

36

н/о

н/о

н/о

9

4

5

Городской тип

29

2

5

20

2

В целом по краю

96

21

44

20

11

Примечания: * – идентификация хантавирусных инфекций по ? 4-кратной разнице в титрах гемагглютининингибирующих антител в сыворотках крови к гомологичному и гетерологичным хантавирусам; ** – < 4-кратная разница в титрах антител к используемым гемагглютинирующим антигенам хантавирусов; н/о – не определено. Очаговые регионы: I – Восточно-Манчжурский холмисто-равнинный; II – Амуро-Уссурийский предгорно-лесной; III – Сихотэ-Алинский горно-таежный.

Amur-вирусная инфекция составила 45,8 ± 5,1 % случаев заболевания (в основном, у жителей II и III очаговых регионов), Hantaan-вирусная инфекция – 21,9 ± 4,2 % случаев (большей частью у жителей I очагового региона), Seoul-вирусная инфекция – 20,8 ± 4,1 % случаев (у жителей г. Владивостока). В 11,5 ± 3,3 % случаев этиологический агент не был установлен. Важно отметить, что при типировании сывороток крови от больных ГЛПС из г. Владивостока, помимо преобладающей Seoul-вирусной инфекции (69,0 ± 8,6 %), были идентифицированы Amur- и Hantaan-вирусные инфекции (17,2 ± 7,0 и 6,9 ± 4,7 % соответственно).

Основной этап нашей работы был посвящен количественной оценке антигенных различий между штаммами близкородственных вирусов Amur и Hantaan (геновариант FE), выделенных от экологически разных видов A. peninsulae и A. agrarius соответственно, с помощью перекрестной кинетической РТГА (табл. 4).

Таблица 4

Результаты идентификации штаммов хантавирусов, изолированных от экологически разных видов мышей рода Apodemus, в кинетической РТГА

Гемагглютинирующие антигены штаммов хантавирусов

Иммунные сыворотки к прототипным штаммам хантавирусов

Hantaan 76-118

HTNV

CG-1820

PUUV

SR-11

SEOV

Вирус Hantaan:

штамм 76–118

штаммы от Apodemus agrarius

1*

0,58–0,60

0,01

0,01

0,18

0,13–0,18

Вирус Puumala:

штамм CG–1820

0,05

1*

0,04

Вирус Seoul:

штамм SR–11

0,2

0,01

1*

Вирус Amur:

штаммы от Apodemus peninsulae

0,27–0,29

0,01

0,25–0,27

Примечания: * – значения показателя А: 1 – соответствует гомологичной связи, десятичная дробь – гетерологичной связи. Значения показателя А от 1 до 0,3 соответствуют внутритиповым антигенным различиям; значения показателя А меньше 0,3 – межтиповым

Значения показателя А для гемагглютинирующих антигенов штаммов вируса Hantaan (геновариант FE) в кинетических реакциях с иммунной сывороткой к прототипному штамму Hantaan 76–118 варьировали в узком диапазоне 0,58–0,6, свидетельствуя об антигенном сходстве штаммов от полевых мышей в пределах одного серотипа Hantaan. Антигены штаммов вируса Amur, изолированные от восточно-азиатских мышей, проявили выраженное межтиповое серологическое отличие со штаммом Hantaan 76–118, имея числовые значения показателя А меньше 0,3 (0,27–0,29), которые соответствуют антигенным отношениям разных серотипов. В кинетических реакциях с иммунной сывороткой к прототипному штамму вируса Seoul антигены штаммов от мышей рода Apodemus ингибировались в меньшей степени, имея значения показателя А, соответствующие межтиповым отношениям: у A. agrarius от 0,13 до 0,18, у A. peninsulae от 0,25 до 0,27. С иммунной сывороткой к прототипному штамму вируса Puumala серологической связи у Amur- и FE–подобных штаммов не выявлено. Таким образом, штаммы вируса Amur продемонстрировали межтиповые антигенные различия со штаммами близкородственных вирусов Hantaan и Seoul, показав в кинетической РТГА с иммунными сыворотками к прототипным штаммам этих вирусов выраженное серологическое отличие (А < 0,3).

На завершающем этапе показана возможность использования модифицированного теста торможения гемагглютинации при ранней дифференциальной диагностике ГЛПС, обусловленной близкородственными вирусами Hantaan и Amur (табл. 5). Парные сыворотки крови, взятые в периоды острого заболевания, ранней и поздней реконвалесценции, титровались с гемагглютинирующими антигенами хантавирусов разных серотипов. При этом эффективность теста при установлении этиологического агента была значительно выше в острый период болезни по сравнению с периодом поздней реконвалесценции.

Таблица 5

Эффективность постановки этиологического диагноза ГЛПС в разные периоды заболевания с помощью модифицированной РТГА

Периоды болезни

Неделя от начала заболевания

Сыворотки крови от больных ГЛПС

обследовано

N

с ≥ 4-кратно превышающим титром антигемагглютининов к гомологичному вирусу

n

M + m (%)

Острый период / 1–2 неделя

102

89

87,2 ± 3,3

Период ранней реконвалесценции / 3 неделя

96

70

72,9 ± 4,5

Период поздней реконвалесценции / 4–5 неделя

48

18

37,5 ± 7,0

Многообразие хантавирусов – род Hantavirus в настоящее время в общей сложности включает более 40 видов, из которых 22 считаются патогенными для человека – вызывает большой интерес к изучению их антигенных связей. Как известно, критерием для типовой идентификации хантавирусов являются различия, установленные с помощью генетического и филогенетического анализов, или ? 4-кратная разница в титре антител с гомо- и гетерологичными вирусами в реакции нейтрализации. Существенным недостатком реакции нейтрализации являются трудоемкость и длительность получения результатов в связи с замедленной репликацией хантавирусов; в обычной постановке РТГА довольно трудно установить различия между штаммами хантавирусов, имеющих близкие генетические связи между собой. Более высокая специфичность кинетической РТГА, по сравнению с РТГА, проявилась при изучении антигенных взаимосвязей близкородственных хантавирусов. Использование кинетической РТГА позволило выявить межтиповые антигенные различия между вирусами Amur и Hantaan (геновариант FE). Значительные отличия вируса Amur от других хантавирусов, выявленные на геномном уровне [12], дают основание предположить, что учет кинетики взаимодействия антител иммунных сывороток с гомо- и гетерологичными гемагглютинирующими антигенами позволяет в определенной степени оценивать различия в генных продуктах М-сегмента – оболочечных гликопротеинах Gn и Gc (ранее G1 и G2, которые менее консервативны, чем нуклеокапсидный белок N. Данные типирования сывороток от больных ГЛПС тестами торможения гемагглютинации подтвердили эпидемиологическую значимость трех вирусов – Amur, Hantaan (геновариант FE) и Seoul – в заболеваемости ГЛПС на территории Приморского края, согласуясь с результатами молекулярно-генетических исследований образцов РНК из крови больных ГЛПС и органов инфицированных диких животных [3, 4].

Заключение

Таким образом, проведенные исследования продемонстрировали эффективность применения модифицированных тестов торможения гемагглютинации при изучении и идентификации близкородственных хантавирусов и вызываемых ими инфекций. Количественная оценка серологических связей штаммов хантавирусов в кинетической постановке РТГА выявила межтиповые антигенные отличия вируса Amur от серотипов Hantaan, Seoul и Puumala, указывая на самостоятельность вируса Amur в качестве отдельного серотипа в роду Hantavirus. Подтверждена эпидемиологическая значимость трех серотипов хантавирусов – Amur, Hantaan и Seoul – в заболеваемости ГЛПС на территории Приморского края. Возможность проведения ранней этиологической серодиагностики ГЛПС имеет большое практическое значение при выборе тактики ведения и лечения больных, а также научном планировании и организации противоэпидемических мероприятий на эндемичных территориях с природными очагами циркуляции нескольких патогенных хантавирусов.

Рецензенты:

Коршукова О.А., д.м.н., профессор, руководитель научного отдела, ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Владивосток;

Зайцева Е.А., д.м.н., профессор кафедры микробиологии и вирусологии, ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Владивосток.

Работа поступила в редакцию 06.10.2014.