Изучение адаптационно-приспособительных возможностей детского организма с позиций системной организации функций, включая клеточно-молекулярный уровень, представляет собой одно из фундаментальных направлений в физиологии и медицине [7]. Нейрохимические процессы в функциональных системах, в том числе и вегетативной, осуществляются при участии клеточных мембран, являющихся метаболической и регуляторной базой для процессов интеграции на уровне всего организма [1]. Зачастую на клеточном уровне формируются доклинические признаки вегетативной дизрегуляции. Целью исследования является изучение вегетативной регуляции на уровне клеточных мембран с учетом особенностей липидной компоненты биомембран у здоровых школьников, что необходимо для оценки их индивидуальной адаптации.
Материалы и методы исследования
Обследовано 84 школьника г. Красноярска в возрасте от 7 до 15 лет. Учащимся проведено сомато-неврологическое обследование с расширенным изучением функционального состояния вегетативной нервной системы (ВНС) методом кардиоинтервалографии (КИГ) с определением исходного вегетативного тонуса (ИВТ) [2, 3]. Дети имели средние показатели физического и полового развития.
Регуляторные возможности на клеточном уровне оценивались при помощи микрофлуориметрии на спектрофлуориметре MPF-4 («Hitachi») [5]. Использовался флуоресцентный зонд хлортетрациклин (ХТЦ) для проведения функциональных проб с экзогенными биорегуляторами ВНС: ацетилхолином, адреналином и дексаметазоном. Флуоресцентный зонд ХТЦ вводился в суспензию мембран эритроцитов in vitro с биорегуляторами ВНС в физиологических дозах. Оценивалась динамика флуоресценции зонда ХТЦ по пиковым и скоростным показателям. Вышеуказанным методом изучены физико-химические свойства мембран эритроцитов с определением текучести глубоких слоев мембран по эксимеризации зонда пирена и вязкости поверхностных структур по анизотропии зонда 1-анилинонафталин-8-сульфонат (АНС) [4]. Результаты выражали в относительных единицах (отн.ед.). Вычисляли показатель текучести поверхностных слоев мембран – 1/ показатель вязкости поверхностных структур. Исследование липидной структуры мембран эритроцитов проводили при помощи метода тонкослойной хроматографии [6]. Определяли величины липидных компонентов: для нейтральных липидов – общие фосфолипиды (ОФЛ), свободный холестерол (СХС), свободные жирные кислоты (СЖК), триацилглицериды (ТГ); для фосфолипидов – лизофосфатидилхолин (ЛФХ), сфингомиелин (СМ), фосфатидилсерин+фосфатидилинозитол (ФС+ФИ), фосфатидилхолин (ФХ), фосфатидилэтаноламин (ФЭА). Результаты содержания фракций выражали в процентах. Вычисляли интегральные коэффициенты: ОФЛ/СХС, СЖК/ТГ, ФЭА/ФХ.
Цифровой материал обработан стандартным пакетом программ STATISTICA, ver. 6.0. Количественные признаки оценивались с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни (M–W) при сравнении двух несвязанных выборок. Для множественного сравнения более чем двух выборок – критерий Крускала-Уоллиса (K-W). Количественные параметры представлены в виде Ме – медиана, 1090 ‰ – процентили. Качественные признаки представлены в виде абсолютных и относительных (в %). Анализ зависимости признаков проводился с помощью непараметрического коэффициента корреляции по Спирмену. Изменения считались статистически значимыми при уровне значимости Р < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Выделены следующие варианты мембранной реактивности клеток согласно запатентованному нами способу [5]. Полученные данные представлены в табл. 1.
1. Адекватный функциональный стереотип клеточной мембраны – распространенный среди здоровых детей: «сбалансированный холин-адрено-глюкокортикоидный тип реакций» (СХАГ-тип, 39,3 % случаев) с оптимальной чувствительностью эритроцитарных мембран ко всем биорегуляторам, отражающий равновесное состояние клеточных механизмов вегетативной регуляции. Он характеризовался совпадением характера регуляции на уровне клетки и на уровне целого организма (78,8 % детей с ИВТ-эйтонией), формировал у этих детей удовлетворительную адаптацию и являлся контрольным; «сбалансированный холинергический тип реакций» (СХ-тип, 32,1 % случаев) – с преобладающей реакцией эритроцитарных мембран на АХ (Р < 0,001) в сравнении с контролем, проявляющийся совпадением характера регуляции на различных уровнях организации биосистемы, включая организменный (в равной степени дети с ИВТ-ваготонией и с ИВТ- эйтонией).
Таблица 1
Показатели реактивности мембран эритроцитов при нагрузочных пробах с биорегуляторами у здоровых детей (в условных единицах)
|
Показатели флуоресценции зонда ХТЦ с биорегуляторами |
Типы реактивности |
Статистическая значимость (Р) |
|||||
|
СХАГ-тип n = 33 |
СХ-тип n = 27 |
АГ-тип n = 17 |
ГХАГ-тип n = 7 |
по M–W |
по К–W |
||
|
[1] |
[2] |
[3] |
[4] |
||||
|
ФЛ пик. АХ (усл. ед.) |
Ме |
31,00 |
31,00 |
25,00 |
25,00 |
Р1–3 < 0,001 Р1–4 < 0,001 |
р < 0,001 |
|
10–90 ‰ |
29,00– 34,00 |
29,00– 36,00 |
29,00– 36,00 |
19,00– 27,00 |
|||
|
V включ. АХ (усл. ед./мин) |
Ме |
0,74 |
0,77 |
0,35 |
0,50 |
P1–3 < 0,001 P1–4 < 0,001 |
Р < 0,001 |
|
10–90 ‰ |
0,57–0,94 |
0,59– 0,98 |
0,20– 0,61 |
0,24–0,88 |
|||
|
ФЛ пик. АД (усл.ед.) |
Ме |
30,50 |
25,00 |
29,50 |
24,50 |
P1–2 < 0,001 P1–4 = 0,0040 |
Р < 0,001 |
|
10–90 ‰ |
26,00– 36,00 |
20,50– 28,00 |
26,00– 32,00 |
19,50– 29,00 |
|||
|
V включ. АД (усл. ед./мин.) |
Ме |
0,77 |
0,42 |
0,74 |
0,47 |
P1–2 < 0,001 P1–4 = 0,0030 |
Р < 0,001 |
|
10–90 ‰ |
0,50– 0,95 |
0,16–0,60 |
0,55– 0,96 |
0,18– 0,54 |
|||
|
ФЛ пик. ДМЗ (усл. ед.) |
Ме |
30,00 |
25,00 |
30,00 |
25,00 |
P1–2 < 0,001 P1–4 = 0,0020 |
Р < 0,001 |
|
10–90 ‰ |
27,00– 34,50 |
21,80– 28,50 |
27,00– 36,00 |
21,00– 30,50 |
|||
|
V включ. ДМЗ (усл. ед./мин.) |
Ме |
0,86 |
0,44 |
1,01 |
0,41 |
P1–2 < 0,001 P1–4 = 0,0109 |
Р < 0,001 |
|
10–90 ‰ |
0,52– 1,20 |
0,30– 0,57 |
0,51– 1,15 |
0,29– 0,98 |
|||
2. «Адреноглюкокортикоидный тип реакций» (АГ-тип) – менее многочисленный тип биомембран (20,2 %), характеризующийся высокой симпатической активностью клеточного звена вегетативной регуляции параметрам флуоресценции на АД и ДМЗ (Р < 0,001) в сравнении с контролем и совпадением характера регуляции на различных уровнях организации биосистемы, включая организменный (в 45,3 % случаев дети с ИВТ-симпатикотонией), что отражает напряженный вариант адаптации.
3. «Гипосинергизм холин-адрено-глюкокортикоидный тип реакций» (ГХАГ-тип)– самый малочисленный тип биомембран (8,3 %) со сниженной реакцией клеточных мембран на все биорегуляторы (Р < 0,01 – Р < 0,001), отражающий функциональную слабость физиологических механизмов регуляции с возможным их истощением. В эту группу вошли дети с различным ИВТ, что свидетельствовало о несоответствии между различными уровнями регуляции (клеточным и целостного организма) и расценивалось как доклинические проявления синдрома вегетативной дисфункции и отражает неудовлетворительную адаптацию у этих детей.
Проведен анализ содержания липидов в мембранах у здоровых детей в зависимости от типа реактивности клеточных мембран. Результаты представлены в табл. 2 и 3.
Таблица 2
Содержание фракций нейтральных липидов в мембранах эритроцитов у здоровых детей с учетом типа реактивности клеточных мембран (в % от суммы всех фракций)
|
Показатели фракций нейтральных липидов в мембранах эритроцитов |
Типы реактивности |
Статистическая значимость (Р) |
|||||
|
СХАГ-тип n = 33 |
СХ-тип n = 27 |
АГ-тип n = 17 |
ГХАГ-тип n = 7 |
по M–W |
по К–W |
||
|
[1] |
[2] |
[3] |
[4] |
||||
|
ОФЛ |
Ме |
28,86 |
27,83 |
26,73 |
25,64 |
P1–3 < 0,001 P1–4 < 0,001 |
Р < 0,001 |
|
10–90 ‰ |
24,19– 36,10 |
20,20– 34,00 |
18,65– 29,30 |
11,33– 27,55 |
|||
|
СХС |
Ме |
46,80 |
45,92 |
48,72 |
49,28 |
P1–3 < 0,001 P1–4 < 0,001 |
Р < 0,001 |
|
10–90 ‰ |
14,19– 52,62 |
40,85–54,01 |
42,07– 57,73 |
43,16– 54,20 |
|||
|
СЖК |
Ме |
11,36 |
11,41 |
12,53 |
14,78 |
P1–2 < 0,001 P1–4 = 0,0040 |
Р < 0,001 |
|
10–90 ‰ |
8,21– 14,69 |
7,29– 16,16 |
10,18–17,32 |
11,20– 25,00 |
|||
|
ТГ |
Ме |
12,71 |
13,19 |
12,39 |
11,25 |
P1–2 < 0,001 P1–4 = 0,0030 |
Р < 0,001 |
|
10– 90 ‰ |
7,66– 17,91 |
8,06– 19,93 |
6,36– 17,77 |
4,51– 20,08 |
|||
Таблица 3
Содержание фракций фосфолипидов в мембранах эритроцитов у здоровых детей с учетом типа реактивности клеточных мембран (в % от суммы всех фракций)
|
Показатели фракций фосфолипидов в мембранах эритроцитов |
Типы реактивности |
Статистическая значимость (Р) |
|||||
|
СХАГ-тип n = 33 |
СХ-тип n = 27 |
АГ-тип n = 17 |
ГХАГ-тип n = 7 |
по M–W |
по К–W |
||
|
[1] |
[2] |
[3] |
[4] |
||||
|
ЛФХ |
Ме |
2,68 |
2,38 |
2,91 |
5,05 |
P1–3 < 0,001 P1–4 < 0,001 |
Р < 0,001 |
|
10–90 ‰ |
1,77– 4,25 |
1,95–4,53 |
2,09– 4,77 |
2,74–6,39 |
|||
|
СМ |
Ме |
17,89 |
17,55 |
17,81 |
19,35 |
P1–3 < 0,001 P1–4 < 0,001 |
Р < 0,001 |
|
10–90 ‰ |
13,10– 22,38 |
10,09– 20,10 |
14,75– 25,30 |
12,31– 25,40 |
|||
|
ФХ |
Ме |
31,90 |
28,31 |
30,94 |
29,85 |
P1–2 < 0,001 P1–4 = 0,0040 |
Р < 0,001 |
|
10–90 ‰ |
27,13– 38,62 |
19,45– 32,12 |
20,40– 43,90 |
24,42– 43,10 |
|||
|
ФИ + ФС |
Ме |
7,41 |
7,64 |
7,35 |
10,81 |
P1–2 < 0,001 P1–4 = 0,0030 |
Р < 0,001 |
|
10–90 ‰ |
5,72– 16,21 |
5,82– 16,6 |
5,46– 16,60 |
4,67– 16,21 |
|||
|
ФЭА |
Ме |
40,82 |
43,52 |
41,94 |
33,82 |
P1–2 = 0,0380 P1–4 = 0,0030 |
Р < 0,001 |
|
10–90 ‰ |
24,96– 44,51 |
36,54– 50,86 |
25,82– 46,76 |
26,33– 44,46 |
|||
Для эритроцитарных мембран СХАГ-типа реактивности характерно оптимальное соотношение мембраностабилизирующих и легкоокисляемых холинсодержащих фракций (ОФЛ/СХС 0,61 ± 0,02 отн. ед., СЖК /ТГ 1,12 ± 0,07 отн. ед., ФЭА/ФХ 1,33 ± 0,06 отн. ед.) и при низком уровне детергентной фракции ЛХФ. Показатели СХАГ-типа использованы в качестве контрольных. Биомембраны СХ-типа реактивности в метаболическом плане более лабильны: накопление в мембране легкоокисляемой фракции ФЭА (Р = 0,0380) и повышение, соответственно, соотношения ФЭА/ФХ (1,66 ± 0,10 отн. ед. в сравнении с контролем 1,33 ± 0,06 отн. ед., Р = 0,0006). Однако в целом показатели структурных липидов приближались к оптимальному варианту. Структуре эритроцитарных мембран АГ-типа реактивности свойственны признаки дестабилизации, соответствующие в целом адренергическому состоянию: снижение ОФЛ (Р = 0,0035) при тенденции к увеличению СХС (Р = 0,0581), что сказывается на уменьшении коэффициента ОФЛ/СХС (0,51 ± 0,03 отн. ед. в сравнении с контролем 0,61 ± 0,02 отн. ед., Р = 0,0024). В эритроцитарных мембранах ГХАГ-типа реактивности наряду с дестабилизационными признаками, соответствующими АГ-типу реактивности: снижение ОФЛ (Р = 0,0093) и коэффициента ОФЛ/СХС (0,47 ± 0,04 отн. ед. в сравнении с контролем 0,61 ± 0,02 отн. ед., Р = 0,0037), обнаруживается дополнительный дестабилизирующий фактор в виде повышения СЖК(Р = 0,0133), что служит доказательством интенсификации процессов перекисного окисления липидов и направлено на дестабилизацию мембраны.
Вариабельность содержания структурных липидов сказывается на физико-химическом состоянии мембраны. Результаты исследований представлены в табл. 4.
Таблица 4
Физико-химические показатели мембран эритроцитов у здоровых детей в зависимости от типа реактивности клеточных мембран (в относительных единицах)
|
Анализируемые показатели |
Типы реактивности |
Статистическая значимость ( Р ) |
|||||
|
СХАГ-тип n = 33 [1] |
СХ- тип n = 27 [2] |
АГ- тип n = 17 [3] |
ГХАГ-тип n = 7 [4] |
по M–W |
по К–W |
||
|
Текучесть поверхностных слоев мембраны (анизотропия АНС) |
Ме |
3,85 |
4,17 |
3,85 |
2,85 |
P1–2 = 0,0318 P1–4 = 0,0104 |
Р = 0,0335 |
|
10–90 ‰ |
3,33– 4,55 |
3,33– 5,26 |
2,44– 4,55 |
2,38– 4,35 |
|||
|
Текучесть глубоких слоев мембраны (эксимеризация пирена) |
Ме |
0,38 |
0,40 |
0,31 |
0,26 |
P1–2 = 0,0284 P1–3 = 0,0287 P1–4 = 0,0162 |
Р = 0,0254 |
|
10–90 ‰ |
0,28–0,48 |
0,35– 0,66 |
0,16– 0,43 |
0,20– 0,40 |
|||
СХАГ-типу реактивности клеточных мембран соответствует стабильное состояние липидной матрицы с оптимальными показателями текучести поверхностных и глубоких слоев, которые приняты в качестве контроля. Физико-химические свойства эритроцитарных мембран у детей с СХ-типом реактивности в сопоставлении с контролем характеризуются повышением текучести поверхностных (Р = 0,0318) и глубоких (Р = 0,0284) слоев, что свидетельствует о повышении функциональной активности мембраны и отражает ее лабильность. Физико-химическое состояние биомембран у детей с АГ-типом реактивности в сопоставлении с контролем характеризуется статистически значимым снижением показателя текучести глубоких слоев мембраны (Р = 0,0287). Полученные данные свидетельствуют об увеличении силы притяжения липидов в клеточной мембране и, соответственно, снижении способности свободного перемещения в пределах бислоя. У детей с ГХАГ-типом реактивности физико-химическое состояние клеточных мембран характеризуется в сопоставлении с контролем статистически значимым уменьшением показателей текучести поверхностных (Р = 0,0104) и глубоких слоев мембраны (Р = 0,0162), что затрудняет работу мембранных структур и отражает состояние перенапряжения звеньев регуляции в клеточной подсистеме.
Анализ корреляционных связей показывает, что физико-химическое состояние клеточных мембран зависит от количественного содержания легко и трудноокисляемых мембранных липидов. Наиболее выражены корреляционные взаимосвязи в группе детей с ГХАГ-типом реактивности: уровень текучести глубоких слоев мембран имеет положительную корреляционную связь с содержанием трудноокисляемого фосфолипида СМ (R = 0,86, P = 0,0137, для N = 7) и отрицательную – с фракцией СХС (R = – 0,82, P = 0,0234, для N = 17). Наряду с этим наблюдается отрицательная корреляционная связь между текучестью поверхностных слоев мембран и мембраностабилизирующей фракцией ФХ (R = – 0,86, P = 0,0137, для N = 7) и положительная – с суммарной легкоокисляемой фракцией ФИ + ФС (R = 0,89, P = 0,0068, для N = 7). Установление большего числа корреляционных связей у детей с ГХАГ-типом реактивности отражает состояние перенапряжения звеньев регуляции в клеточной подсистеме.
Заключение
Предложены новые критерии объективной оценки адаптационных возможностей здоровых детей с выделением различных вариантов адаптации: удовлетворительной, напряженной и неудовлетворительной. В основу градации функциональных состояний положены исследования различных уровней вегетативной регуляции, включая уровень клеточных мембран: по реакции вегетативного ответа плазматической мембраны на биорегуляторы ВНС, параметрам структурно-функциональной организации и физико-химическим свойствам биомембран.
Рецензенты:
Смирнова О.В., д.м.н., заведующая лабораторией клинической патофизиологии, ФГБУН «Научно-исследовательский институт проблем Севера», г. Красноярск;
Поливанова Т.В., д.м.н., г.н.с. клинического отделения патологии пищеварительной системы у взрослых и детей, ФГБНУ «Научно-исследовательский институт проблем Севера», г. Красноярск.