Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,087

ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛИМОРФИЗМОВ ГЕНОВ ФАКТОРОВ РОСТА С РАЗВИТИЕМ ПЕРВИЧНОЙ ОТКРЫТОУГОЛЬНОЙ ГЛАУКОМЫ

Кириленко М.Ю. 1
1 ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»
Сосудистая теория развития глаукоматозного процесса в настоящее время является наиболее распространенной. Одним из важнейших механизмов, поддерживающих кровоток в головке зрительного нерва (ГЗН) является ауторегуляция гемодинамики. Значительную роль в ауторегуляции кровообращения играет эндотелий, продуцирующий фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и инсулиноподобный фактор (IGF). Проведено исследование ассоциаций полиморфизмов эндотелиального (–460 T/C VEGF-A) и инсулиноподобного фактора роста (–G1245A IGF-1) с развитием первичной открытоугольной глаукомы (ПОУГ). Материалом для исследования послужила выборка из 453 индивидуумов: 252 больных первичной открытоугольной глаукомой и 191 человек контрольной группы. Анализ генетических полиморфизмов проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК. В результате проведенного комплексного анализа аллелей и генотипов исследуемых локусов факторов роста установлена ассоциация сочетания генотипа –1245GA IGF-1 и аллеля –460C VEGF-A с формированием предрасположенности к ПОУГ.
первичная открытоугольная глаукома (ПОУГ)
ПЦР-анализ
полиморфизм генов
эндотелиальный фактор роста (VEGF)
инсулиноподобный фактор роста (IGF)
1. Егоров Е.А. Глаукома. Национальное руководство / под ред. Е.А. Егорова. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2013. – 824 с.
2. Нестеров А.П. Глаукома. – М.: Медицина, 2008. – 255 c.
3. Никитин Н.А., Кузбеков Ш.Р. Роль TGFβ в офтальмологии // Цитокины и воспаление. – 2009. – Т. 8, № 1. – С. 3–9.
4. Рыжков И.И. Полиморфизм генов тканевых факторов роста и его влияние на развитие и клиническое течение идиопатического сколиоза: автореф. дис. ... канд. мед. наук. – Белгород, 2011. – 25 с.
5. Bidwell J., Keen L., Gallageher G. Cytokine gene polymorphism in human disease: on-line databases, supplement 1. // Genes Immun. – 2001. – № 2. – Р. 61–70.
6. Bloor C. A., Knight A. R., Ravindra K. Differential mRNA Expression of Insulin-like Growth Factor-1 Splice Variants in Patients With Idiopathic Pulmonary Fibrosis and Pulmonary Sarcoidosis // Am. J. Respir. Crit. Care Med. – 2001. – Vol. 164, № 2. – P. 265–272.
7. Ching Y.-H. The Use of growth factors and other humoral agents to accelerate and enhance burn wound healing / Y.-H. Ching, T. L. Sutton, Y. N. Pierpont // Journal of Plastic Surgery. – 2011. – № 11. – P. 429–449.
8. Ester W.A., van Meurs J.B., Arends N.J. The -G1245A IGF1 polymorphism is related with small head size and less brain sparing in small for gestational age born children // Eur. J. Endocrinol. – 2009. – № 160 (4). – Р. 549–55.
9. Favorov A.V. A Gibbs sampler for identification of symmetrically structured, spaced DNA motifs with improved estimation of the signal length / Favorov A.V., Gelfand M. S., Gerasimova A. V. // Bioinformatics. – 2005. – № 21. – P. 2240–2245.
10. Flammer J., Orgul S., Costa V. The impact of ocular blood flow in glaucoma // Prog. Ret. Eye Res. – 2002. – № 21. – P. 359–393.
11. Ray David, Mishra Manoj, Ralph Shirley Association of the VEGF gene with proliferative diabetic retinopathy but not proteinuria in diabetes. // Diabetes. 2004. № 53(3). Р. 861–864.
12. Resch H., Garhofer G., Fuchsjager-Mayrl G. Endothelial dysfunction in glaucoma. // Acta Opthalmologica. – 2009. – № 87. – Р. 4–12.
13. Rivera E. J., Goldin A., Fulmer N. Insulin and insulin-like growth factor expression and function deteriorate with progression of Alzheimer’s disease: Link to brain reductions in acetylcholine // Journal of Alzheimer’s Disease. – 2005. – P. 247–268.
14. Szaflik J.P., Wysocki T., Kowalski M. An association between vascular endothelial growth factor gene promoter polymorphisms and diabetic retinopathy // Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. – 2008. – Vol. 246. – № 1. – P. 39–43.
15. АРSampler, Available at: http://sources.redhat.com/cygwin.

Глаукома – группа хронических заболеваний глаз с различной этиологией, характеризующихся постоянным или периодическим повышением внутриглазного давления (ВГД), вызванных нарушением оттока водянистой влаги, сопровождающихся оптической нейропатией, которая проявляется атрофией зрительного нерва (с экскавацией) и характерными изменениями поля зрения [1]. Первичная открытоугольная глаукома (ПОУГ) – наиболее часто встречающаяся форма глаукоматозного процесса, составляет от 72,3 до 96,1 % всех видов глауком [2].

Предложены многочисленные теории патогенеза глаукомной оптической нейропатии (ГОН), в которых снижению кровотока, гипоксии и ишемии в головке зрительного нерва (ГЗН), т.е. сосудистым факторам отводится существенная роль [10]. Одним из важнейших механизмов, поддерживающих кровоток в ГЗН, является ауторегуляция кровообращения в питающих ее сосудах. При колебаниях перфузионного давления именно ауторегуляция контролирует гемодинамику. Значительную роль в ауторегуляции кровообращения играет эндотелий, продуцирующий ряд вазоактивных субстанций, среди которых наибольшее значение придается оксиду азота, эндотелину-1, фактору роста эндотелия сосудов (VEGF) и инсулиноподобному фактор (IGF) [12].

Факторами роста (ФР) называют группу белковых молекул, индуцирующих синтез ДНК в клетке. Подобно гормонам эти факторы обладают широким спектром биологического действия на многие клетки – стимулируют или ингибируют митогенез, хемотаксис и дифференцировку [7]. Установлено что важная роль в этиопатогенезе ПОУГ принадлежит ФР, регулирующим деление, миграцию клеток, экспрессию белка и продукцию ряда ферментов, а также участвующим в процессах репарации, стимулируя ангиогенез и пролиферацию клеток [3]. Гены ФР обладают высокой степенью полиморфизма и ассоциированы с риском развития различных хронических заболеваний [4–6, 13, 14].

Целью нашего исследования явилось изучение ассоциаций полиморфизмов генов эндотелиального фактора роста (-460 T/C VEGF-A) и инсулиноподобного фактора роста (–G1245A IGF-1) у больных ПОУГ.

Материалы и методы исследования

Анализ полиморфизмов генов эндотелиального фактора роста (–460 T/C VEGF-A) и инсулиноподобного фактора роста (–G1245A IGF-1) проводили у 453 индивидуумов: 252 больных первичной открытоугольной глаукомой и 191 человек контрольной группы. Среди больных ПОУГ мужчин было 125 (49,6 %), женщин – 127 (50,4 %) (р > 0,05). В контрольной группе распределение по полу было следующим: мужчины – 93 человека (48,7 %), женщины – 98 (51,3 %) (р > 0,05). Средний возраст больных составил 70,53 ± 8,43 лет (варьировался от 46 до 89 лет), в контрольной группе – 68,55 ± 10,57 лет (варьировался от 48 до 87 лет) (р > 0,05). Таким образом, группа контроля не отличалась от группы больных ПОУГ как по полу, так и по возрасту.

Клиническое, лабораторное и инструментальное обследование индивидуумов изучаемых групп проводилось на базе офтальмологического отделения Областной клинической больницы Святителя Иоасафа г. Белгорода.

Типирование молекулярно-генетических маркеров осуществлялось в лаборатории «Молекулярной генетики человека» медицинского факультета Белгородского государственного национального исследовательского университета. Материалом для исследования послужила венозная кровь в объеме 4 мл, взятая из локтевой вены пробанда.

Забор венозной крови производили в пробирки с консервантом, содержащим 0,5 М раствор ЭДТА (рН = 8,0), тщательно перемешивали и хранили при температуре 4 °С не более одной недели.

Выделение геномной ДНК из периферической крови осуществлялось методом фенольно-хлороформной экстракции в два этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляли 30 мл лизирующего буфера, содержащего 320 г сахарозы, 1 % тритон Х-100, 5 мл MgCl2, 10 мл трис-HCl (pH = 7,6). Полученную смесь перемешивали и центрифугировали при 4 °С, 4000 об/мин. в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливали, осадок ресуспензировали. Затем прибавляли 4 мл ЭДТА-Soline, 400 мкл 10 % SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубировали образец при 40 °С в течение 16 часов.

На втором этапе из полученного лизата последовательно проводили экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин. в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производили отбор водной фазы. ДНК осаждали из раствора двумя объемами охлажденного 96 % этанола. Сформированную ДНК растворяли в бидистиллированной, деионизованной воде и хранили при –20 °С. Выделенную ДНК использовали для проведения полимеразной цепной реакции синтеза (ПЦР) ДНК.

Анализ генетических полиморфизмов -460 T/C VEGF-A (rs 833061) и –G1245A IGF-1 (rs35767) проводили методом ПЦР синтеза ДНК на амплификаторе CFX-96 (Bio-Rad) с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров и зондов (для детекции методом TaqMan) [8, 11].

Для оценки соответствия наблюдаемого распределения генотипов ожидаемому, исходя из равновесия Харди‒Вайберга (HWE), использовали критерий χ2. Об ассоциации аллелей или генотипов с предрасположенностью к заболеванию судили по величине отношения шансов (OR). Рассчитывался доверительный интервал (CI) – интервал значений, в пределах которого с вероятностью 95 % находится ожидаемое значение рассматриваемого параметра.

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программных пакетов «STATISTICA 6.0», «Microsoft Excel 2007», «APSampler/Cygwin».

Результаты исследования и их обсуждение

Изучено распределение полиморфных маркеров генов –460 T/C VEGF-A (rs833061), –G1245A IGF-1 (rs35767) больных ПОУГ и индивидуумов контрольной группы. Результаты анализа ассоциаций данных генетических маркеров с развитием первичной открытоугольной глаукомы представлены в таблице.

Исследование распределения генотипов изучаемых полиморфных маркеров генов показало, что для всех изученных локусов в группе больных ПОУГ и в популяционной выборке эмпирическое распределение генотипов соответствует теоретически ожидаемому при равновесии Харди‒Вайнберга (p > 0,05). Уровень аллельного разнообразия по изученным локусам составил: от Н0 = 0,24 – для локуса –G1245A IGF-1 до Н0 = 0,49 – для локуса –460 T/C VEGF-A среди больных ПОУГ и от Н0 = 0,31 – для локуса – G1245A IGF-1 до Н0 = 0,51 для локуса –460 T/C VEGF-A в популяционной выборке.

При сравнительном анализе частот генетических вариантов исследуемых полиморфных маркеров достоверных различий между больными ПОУГ и контрольной группой не выявлено (p > 0,05).

В результате проведенного комплексного анализа носительства сочетаний аллелей и генотипов исследуемых локусов факторов роста с помощью программного обеспечения АРSampler [15], использующего метод Монте-Карло марковских цепей и байесовскую непараметрическую статистику [9], установлена ассоциация сочетания генотипа –1245GA IGF-1 и аллеля –460C VEGF-A с формированием предрасположенности к первичной открытоугольной глаукоме. Выявлено, что среди больных ПОУГ частота данного сочетания составляет 24,89 %, что в 1,5 раза превышает аналогичный показатель в контрольной группе (16,57 %). Данная комбинация является фактором риска развития ПОУГ (p = 0,03; ОR = 1,67, 95 % CI 1,02-2,74).

Распределение генотипов, наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности, индекса фиксации полиморфных маркеров генов факторов роста среди больных ПОУГ и в контрольной группе

Локусы, показатели

Контрольная группа (n = 191)

Больные ПОУГ (n = 252)

-460 T/C VEGF-A (rs833061)

ΣN

179

244

No(Ne)

–460 TT

48 (46,77)

55 (56,10)

–460 TC

87(89,46)

124 (121,80)

–460 CC

44(42,77)

65 (66,10)

χ2(HWE) (p)

0,13 (> 0,05)

0,08 (> 0,05)

Ho (He)

0,49 (0,50)

0,51 (0,50)

–G1245A IGF-1 (rs35767)

ΣN

185

238

No(Ne)

–1245 AA

9 (5,36)

7 (8,13)

–1245 GA

45 (52,27)

74 (71,73)

–1245 GG

131 (127,36)

157 (158,13)

χ2(HWE) (p)

3,58 (> 0,05)

0,24 (> 0,05)

Ho (He)

0,24 (0,28)

0,31 (0,30)

Примечания: ΣN – объем выборки; N0 – наблюдаемое распределение генотипов; NE – ожидаемое распределение генотипов; χ2(HWE) – показатель соответствия наблюдаемого распределения ожидаемому, исходя из равновесия Харди‒Вайнберга; p – достигнутый уровень значимости для χ2(HWE); H0 – наблюдаемая гетерозиготность; HE – ожидаемая гетерозиготность.

Выводы

Генетические полиморфизмы эндотелиального (–460 T/C VEGF-A) и инсулиноподобного фактора роста (–G1245A IGF-1) ассоциированы с формированием заболевания, комбинация генетических вариантов –1245GA IGF-1 и –460C VEGF-A является фактором риска развития первичной открытоугольной глаукомы (OR = 1,67).

Рецензенты:

Чурносов М.И., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой медико-биологических дисциплин Белгородского государственного национального исследовательского университета, г. Белгород;

Сорокина И.Н., д.б.н., профессор кафедры медико-биологических дисциплин Белгородского государственного национального исследовательского университета, г. Белгород.

Работа поступила в редакцию 15.01.2014.


Библиографическая ссылка

Кириленко М.Ю. ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛИМОРФИЗМОВ ГЕНОВ ФАКТОРОВ РОСТА С РАЗВИТИЕМ ПЕРВИЧНОЙ ОТКРЫТОУГОЛЬНОЙ ГЛАУКОМЫ // Фундаментальные исследования. – 2013. – № 12-2. – С. 222-225;
URL: http://www.fundamental-research.ru/ru/article/view?id=33309 (дата обращения: 15.08.2020).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074